phi) آزمون سیمون سیترات…………………………………………………………..104
شکل 4-4- سالمونلا تیفی تست TSI…………………………………………………………………………………………105
شکل5-4- سالمونلا تیفی را در محیط SIM………………………………………………………………………………..106
شکل6-4- سالمونلا تیفی را در تست متیل رد……………………………………………………………………………….106
شکل 7-4- باند DNA از سالمونلا تیفی از سس مایونز…………………………………………………………………107
شکل 10-4- باند ژن invA بدست آمده از سالمونلا تیفی استخراج شده…………………………………………..108
شکل11-4- باند نردبانی محصول LAMP……………………………………………………………………………………110
شکل12-4- کدورت محصول LAMP…………………………………………………………………………………………111
شکل13-4- نمونه مثبت و منفی بعد از افزودن سایبرگرین…………………………………………………………………111

چکیده
سالمونلا باکتری گرم منفی، متحرک و باسیلی شکل است که خصوصیات عمومی خانواده انتروباکتریاسه را دارا می‌باشد. سالمونلا و سروتیپ‌های آن منبع مهم آلودگی غذاهای انسانی و عامل پاتوژن بسیار قوی و بیماریزا در انسانهاست. امروزه بیش از 2450 سروتیپ سالمونلا شناسایی شده است که برخی از این سروتیپ‌ها عامل بیماری‌هایی از قبیل تب تیفوئید و انتروکولیک در انسان می‌باشند. بیماریهای ناشی از این عامل یک معضل بزرگ بهداشتی در جهان به خصوص در کشورهای در حال توسعه از جمله کشور ما می باشد. بنابراین تشخیص سریع، دقیق و به موقع آن برای جلوگیری از اپیدمی و عوارض مخرب این باکتری ضروری بهنظر میرسد.
روشهای مختلفی برای جداسازی باکتری سالمونلا از نمونه‌های محیطی وجود دارد که شامل: روش‌های کشت سنتی و بیوشیمیایی، سرولوژیکی و مولکولی (از جمله PCR) است. تمام این روشها به زمان طولانی، تعداد زیاد باکتری در نمونه اولیه، تجهیزات گرانقیمت آزمایشگاهی و به افراد متخصص در این زمینه نیاز دارند.
هدف از این مطالعه بررسی کارایی روش نوین تشخیص مولکولی LAMP در تشخیص عامل عفونی سالمونلا تیفی میباشد. بررسی نتایج در تشخیص مولکولی سالمونلاها نشان داد که روش LAMP روشی سریع، ارزان و اختصاصی است و بهجای دستگاههای گرانقیمت PCR و برنامه چرخه حرارتی چند دمایی آن با استفاده از یک بلوک حرارتی بسیار ساده و ارزان و در یک دمای واحد 60 درجه سانتیگراد و همچنین مشاهده کدورت حاصل از فرایند تکثیر ژنها در زمان کوتاهتری به تشخیص اختصاصی این باکتری سالمونلا پرداخت.
این روش می تواند جهت تشخیص مولکولی سریع، دقیق و ارزان با کاربرد گسترده در آزمایشگاههای تشخیصی و بخصوص تشخیص عوامل عفونی در آزمایشگاههای مناطق محروم و آزمایشگاههای سیار مورد استفاده قرار گیرد.
واژه های کلیدی : سالمونلا، تشخیص مولکولی، PCR، LAMP

فصل اول

مقدّمه (اهداف تحقیق)

مقدمه
اعضای جنس سالمونلا، باکتری گرم منفی، میلهایی، بیهوازی اختیاری و بدون اسپور هستند. از آنجا که جایگاه اصلی و طبیعی این باکتری‌ها روده انسان و حیوانات می‌باشد اصطلاحاً آنها را باسیل‌های روده‌ای یا انتریک می‌نامند. از لحاظ شرایط رشد این میکروارگانیسم‌ها باکتری‌های انعطاف‌پذیری بوده و به آسانی با شرایط محیطی خود را هماهنگ می‌کنند این جنس از میکروارگانیسم‌ها به حرارت حساس‌اند. در درجه حرارت‌های پائین امکان بقای آنها بیشتر است .(Connie & Manuselis, 2000)
اکثر سروتیپ‌های سالمونلا پاتوژن‌های بالقوه برای انسان و بسیاری از حیوانات می‌باشند. این باکتری‌ها در دستگاه گوارش مهره‌داران اعم از پستانداران و پرندگان و خزندگان و ماهی‌ها سیطره پیدا کرده، بسته به سروتیپ، شرایط و عوامل متعدد میزبانی، بیماریهایی با نشانه‌های گوناگون و عوارض متفاوت ایجاد می‌کنند .(Merchant & Pocker, 1983)از جمله باکتریهای رودهایی هستند که موجب بیماری تب تیفوئید(حصبه)، تب شبه حصبه و بیماریهای ناشی از مواد غذائی در انسان میگردند(Jay et al., 2005).
بیماریهای ناشی از آلودگی مواد غذائی ناشی از سالمونلا را non typhoidal نامیدهاند. سالمونلا بهطور گستردهایی در محیط زیست از قبیل آب، خاک و مدفوع حیوانات توزیع شده است (Cidrp, 2009). باکتری معمولاً از طریق مدفوع انسان و یا دام دفع شده و باعث آلودگی آب و غذا و محیط می‌گردد. مواد غذائی مانند گوشت، تخممرغ، مرغ، سس مایونز، سبزیجات و غیره ،از ناقلهای اولیه عفونت سالمونلا به انسان هستند(Dolye & Beuchat, 2007)..
سالمونلای غیرتیفوئیدی علت اصلی بیماریهای ناشی از مواد غذائی در سراسر جهان است. که برآورد شده که حدود 4/1 میلیون مورد در سال مورد عفونت غذائی سالمونلا قرار میگیرند(Mead et al., 1999).
از اینرو شناخت و تشخیص به موقع سالمونلا از اهمیت خاصی برخوردار است. با ذکر تمامی این موارد به نظر می‌رسد تشخیص به موقع و کنترل باکتری از وظایف مهم آزمایشگاه‌های میکروب‌شناسی است. امروزه از 3 روش رایج به تشخیص باکتری می‌پردازند:
ـ روش‌های کشت سنتی و آزمایشات بیوشیمیایی.
ـ روش‌های سرولوژیکی.
ـ روش‌های مولکولی.
برای تشخیص استفاده از روشهای سنتی مبتنی بر محیط کشت قابل قبول است ولی وقتگیر است و برای تایید جواب نهایی چند روز بهطول میانجامد .(Andrews & Hammack, 2007) علاوهبر این، روشهای ایمنولوژیک مانند الایزا وIMS نیز برای شناسائی سالمون
لا توسه یافتهاند.
. (Mansfield & Forsythe, 2000 ; FAVRIN , 2001) با اینحال اختصایت کم و هزینههای بالا، استفاده ازین روشها را محدود کرده است. اخیرا روشهای مولکولی مانند PCR و real time PCR بهطور گسترده در شناسائی سالمونلا استفاده میشوند که روشهایی کارآمد و حساس هستند.
Krascsenicsova et al., 2008) ; Eriksson & Aspan, 2007).
با اینحال این روشها نیازمند سیکل حرارتی اختصاصی و دستگاههای گرانقیمتاند. ازاینرو نیاز به یک روش دقیق، حساس، آسان و بهصرفهتر است. در سال 200 یک گروه ژاپنی یک روش تشخیص مولکولی به نام LAMP را معرفی کردند .(Notomi et al., 2000)از آن زمان روش LAMP به عنوان یک روش اختصاصی، حساس و سریع برای شناسائی پاتوژنهای ناشی از مواد غذائی مورد استفاده است. یک روش ساده، بدون نیاز به سیکل حرارتی اختصاصی و دستگاههای گرانقیمت و به آسانی قابل اجرا است(Hara-Kudo et al., 2005; Notomi et al., 2000).
هدف این تحقیق شناسائی باکتری سالمونلا تیفی در سالاد سبزیجات و سس مایونز آلوده با استفاده از روش LAMP، بهعنوان روشی سریع، حساس و اختصاصی میباشد.
اهداف تحقیق در نگاه اجمالی
1. طراحی و بهینهسازی روش LAMP بر اساس ژن تهاجمی invA سالمونلا تیفی
2. تعیین حد حساسیت روش PCR و LAMP به روی ژن تهاجمی invA سالمونلا تیفی
3. مقایسه دو روش PCR و LAMP

مطلب مرتبط :   پایان نامه با واژگان کلیدیسرمایه انسانی، عوامل شخصی، مهاجرت داخلی، نیروی انسانی

فصل دوم

مروری بر تحقیقات انجام شده

1-2- مشخصات جنس سالمونلا
1-1-2- تاریخچه
در سال 1885 یک دامپزشک آمریکائی به نام دانیل المر سالمون برای اولین بار این باکتری را از خوک جدا کرد وآن را باسیلوس کلراسوئیس1 نامید. در سال 1888 جرم دیگری توسط گارتنر از فردی که در اثر گاستروانتریت ناشی از مصرف گوشت نپخته مرده بود جدا شد و آنرا باسیلوس انتریتیدیس نامید که بعداً سالمونلا انتریتیدیس خوانده شد. در سال 1900 خواص این باکتری توسط فردی به نام لینیر بهطور رسمی تصویب گردید. از آنجا که این ارگانیسم ها شبیه به باکتری های جدا شده توسط سالمون بودند، به همین جهت به افتخار کاشف اولیه این باکتری سالمونلا2 نامیدند(Roumagnac et al., 2006).
در فاصله بین سالهای 1925ـ1900 بزرگترین رویداد در کشف سرولوژیکی آنتی‌ژن‌های سوماتیک و فلاژلا در مورد گروه سالمونلا بوسیله لیگنیرز انجام شد. در سال 1926 ترکیبات پادگنی سالمونلا طبقه‌بندی گردید و جدولی به نام جدول کافمن ـ وایت ایجاد شد. در حال حاضر این جدول دارای حدود 2500 سروتیپ است (Bhatia & Nabb , 1980) .
سالمونلا بطور گسترده در طبیعت توزیع شده است مانند آب آلوده، خاک حاوی مدفوع حیوانات و غیره. به طور عمده این باکتریها در رودهی حیوانات ساکن است و مخزن اصلی آلودگی مرغ، تخم مرغ، دام، حیوانات خانگی و خزندگان است(Cidrp, 2009).

2-1-2- خواص شکلی
اعضای جنس سالمونلا باکتریهای میلهای شکل و اندازهی آن 5-2 ?5/1-7 /. میکرون بوده است.گرم منفی، بدون اسپور و متعلق به خانوادهی انتروباکتریاسهاند (J. Antonio , 2009 ; Dolye & Beuchat, 2007) .. اکثر اعضای این جنس متحرک و با تاژهی پریتریشاند بهجز چند مورد استثناء مانند سالمونلا گالیناروم3 و سالمونلا پولوروم4 (et al., 2005 Hara-Kudo).

3-1-2- خواص بیوشیمیایی
اعضای این جنس قادر به تخمیر گلوکز بوده ولی از تخمیر ساکارز و لاکتوز ناتوانند. بیشتر انواع سالمونلا ها گلوکز، مالتوز، مانیتول، دولسیتول، دکسترین و سوربیتول را تخمیر می کنند و اسید و گاز بوجود می آورند. اکثر سویهها H2sرا از منبع سولفوری معدنی تولید کرده و تولید H2S یکی از واکنش های کلیدی در تشخیص سالمونلاها میباشد. به استثنای سروتیپ تیفی5 در بیشتر موارد جدا شده از گلوکز گاز ایجاد میکنند. در سیترات به عنوان تنها منبع کربن رشد میکنند اما برخی از گونه ها مانند سالمونلاتیفی و سالمونلا پاراتیفی A سیترات منفی هستند Aksoy, 2004)). این باکتری اکسیداز منفی و کاتالاز مثبت بوده. از تولیدات این باکتری لیزین در کربوکسیلات، سولفات هیدروژن وارنیتین می‌باشد.
( Alcamo , 1997 ; Connie & Manuselis, 2000) .
از دیگر ویژگیهای بیوشیمیایی این است که اکثر سالمونلاها عدم تولید اندول، عدم تولید آنزیم‌های اوره آز، لیپاز، دزاکسی ریبونوکلئاز، فنیل‌آلانین و تریپتوفان دآمیناز، دکربوکسیلاسیون اسیدهای آمینه لیزین، اورنیتین و آرژنین، واکنش مثبت در آزمایش متیل‌رد(MR) و واکنش منفی در آزمایش وژس ـ پروسکوئر (VP) مثبت می‌باشد.( (Alcamo , 1997 ; Dolye & Beuchat , 2007.

مطلب مرتبط :   پایان نامه با واژگان کلیدیرضایت از زندگی، پایگاه اقتصادی، توزیع فراوانی، مقطع تحصیلی

4-1-2- مقاومت در برابر عوامل فیزیکی و شیمیایی
این باکتری روی محیط کشت ماهها زنده میمانند. حرارت 60 درجه را 15 تا 20 دقیقه تحمل میکنند، سالمونلاها مدت 13 ماه در لاشههای آلوده نگهداری شده در یخچال، 120 روز درآب، 280 روز در خاک باغچه و مدت بسیار طولانی در شیرخشکهای بدون چربی و موادغذایی دارای تخم مرغ زنده میمانند. سالمونلاها نسبت به سرما مقاوم بوده و مدت3 ماه در برف و یخ زنده مانده واز این طریق میتوانند اپیدمی بهوجود آورند. کلرامنفیکل استرپتومیسین و بسیاری از آنتی بیوتیک های وسیع الطیف بر آن موثرند پنی سیلین بر آن کاملا بیاثر است. سالمونلاها همچنین نسبت به املاح صفراوی مقاومند وبه همین دلیل از این مواد نیز علاوه بر رنگها در تهیه محیط‌های غنی‌کننده استفاده می‌کنند Aksoy, 2004)).

5-1-2- خواص کشت
اعضای این جنس هوازی بیهوازی اختیاری میباشند. مزوفیل بوده و رشد بهینهی آن در دمای 37درجه است.با اینحال برخی از سالمونلاهادر شرایط شدید زیست محیطی مانند درجه حرارت بالای 54 درجه و سرمای 4-2 درجه را تحمل کنند. pH مناسب
برای رشد آن 5/7-5/ 6 می باشد ولی pH حدود 9- 5/4 را می تواند تحمل کند و اگر pH پائینتر از 4 برود باعث از بین رفتن میکروارگانیسم میشود. pH بیشتر از 9 صرفا از رشد آن جلوگیری میکند. غلظت نمک 3/ 5 % بالاتر عاملی در جهت جلوگیری از رشد و تکثیر باکتری است (Jay et al., 2005 ; Doyle.M, 2007).
اکثر سالمونلاها در روی آگار مغذی بعد از 24 ساعت پرگنه هایی به قطر 3-2 میلی متر و به رنگ سفید، خاکستری، مرطوب ،کروی، مسطح، برجسته و صاف ایجاد می کنند. اندازه و درجه کدورت پرگنه ها به نوع سروتیپ بستگی دارد. سالمونلاها در محیط های مایع نظیر آبگوشت مغذی و آب پپتونه رشد زیادی دارند Jay et al., 2005)).
انواع محیط‌های غنی کننده می‌توان به آبگوشت تتراتیونات آبگوشت سلنیت F، آبگوشت را پاپورت (حاوی کلریدمنیزیم و سبزمالاشیت) و آبگوشت سلنیت سیستین اشاره کرده معمولاً بعد از 24ـ18 ساعت از محیط‌های غنی کننده روی محیط‌های انتخابی جامد کشت می‌دهند. از محیط‌های انتخابی و تفریقی می‌توان به محیط مک‌کانکی و محیط سالمونلا ـ شیگلا، محیط سبز درخشان، محیط آهن لیزین‌دار، محیط داکسی کلات سیترات یا محیط لیفسون(DCA)، محیط هکتوئن و محیط داکسی کلات ـ لیزین ـ گزیلور اشاره کرد. محیط بیسموت سولفات آگار، نیز به عنوان محیط انتخابی برای جداسازی سالمونلا مورد استفاده قرار می‌گیرد چرا که قدرت انتخابگری این محیط بالاست. این باکتری‌ها معمولاً کربوهیدرات را با تولید اسید و گاز تخمیر می‌کنند.
. (D’ Aoust , 1991 ; D’ Aoust , 1998 ; Connie & Manuselis, 2000 ; Ferretti , 2001)

6-1-2 شرایط رشد سالمونلاها
سالمونلاها قادرند در محیط‌های ساده آزمایشگاهی رشد نمایند و از ترکیبات ساده کربن‌دار به عنوان منبع کربن و انرژی و از تعداد زیادی از ترکیبات ازت به عنوان منبع نیتروژن استفاده کنند (D’Aoust , 1998).
اکثر سالمونلاها پروتوتروف بوده و در میحط حداقل نمک با یک منبع کربن مناسب و یا محیط حداقل آمونیوم ـ گلوکز توانایی رشد دارند .(Morse, 1988)اکثر سویه‌های سالمونلاتیفی جهت رشد احتیاج به اسید آمینه تریپتوفان دارند. رشد سالمونلاها در دامنه حرارتی 5 تا 47 درجه است ولی دمای اپتیمم 37 درجه است .(D’ Aoust , 1991)
بعضی از گونه‌های سالمونلا درجه حرارت‌های بالاتر از c ْ54 را نیز تحمل می‌کنند و عده‌ای دیگر خواص سرما دوستی را بوسیله رشد کردن در c ْ4ـ2 از خود نشان دادند. دردرجه حرارت‌های پائین امکان رشد و بقای سالمونلا بیشتر است. گزارش شده که سالمونلاها نسبت به خشکی حساسند از اینرو انتشار آنها از طریق گرد و غبار و ذرات خشک کمتر از آب و مواد غذایی مرطوب است. بقاء سالمونلاها به طور نسبی به درجه حرارت محیط وابسته است .(Davis , 1996) به طوریکه

Comments (0):

Write a comment: