ase (100U)
Cinnagen, Iran
PCR Buffer 10X
Cinnagen, Iran
dNTP mix (10 Mm)
Cinnagen, Iran
Primer
Sigma, USA
Glycerol
Merck, Germany
Nucleic Acid Extraction Kit
Vivantis, Malaysia
Shigella – salmonella agar

MgCl2
Merck, Germany
Salmonella typhi
اهدایی دکتر مجید مقبلی
dH2O (DNase & RNase free)
Fermentas, Lithuania
Nutrient agar
Merck (Germany)
Urease
Merck (Germany)
Chloroform
Merck (Germany)
Phenol
Sina clon bioscience

باکتری هدف از طرف دکتر مجید مقبلی اهدا شد و برای تائید هویت باکتری برای رنگآمیزی و تستهای بیوشیمیای آماده شد.

3-3- رنگ آمیزی گرم
ابتدا از کلنی باکتری موردنظر ، روی لام گستره ای تهیه کرده و گستره را خشک و سپس فیکس کردیم . سپس روی آن رنگ کریستال ویوله ریخته و بعد از یک دقیقه رنگ را خالی کرده و لام شسته شد، بعد از آن روی گستره محلول لوگل ریخته و بعد از گذشت زمان یک دقیقه و تشکیل کمپلکس کریستال ویوله لوگل ، عمل رنگ بری با مخلوط الکل- استون انجام شد. در این مرحله اگر باکتری گرم مثبت باشد کمپلکس کریستال ویوله لوگل را از دست نمی دهد و بنفش می ماند ولی اگر گرم منفی باشد ، کمپلکس را از دست داده و بی رنگ می شود . مرحله بعد معرف رنگی سافرانین را اضافه کرده و بعداز 30 تا 60 ثانیه رنگ را خالی کرده و گسترش با آب شسته شد.
باکتریهای دارای مشخصه لازم، برای انجام تستهای بیوشیمیایی جهت شناسایی و افتراق در محیط نوترینت آگار جدید کشت داده شدند. تستهای بیوشیمیایی استفاده شده برای افتراق باکتری هدف در ذیل آمده است.
4-3- تستهای بیوشیمیایی
این تست که از تعدادی از محیطهای جامد و نیمه جامد و مایع تشکیل یافته است، فعل و انفعالات مختلفی که توسط باکتریها انجام میشود را مشخص میکند. جهت مشخص شدن جنس باکتری در خانواده انتروباکتریاسه از تست IMVC بهطور معمول استفاده میگردد، که عبارتند از :تست اندول70، متیل رد71، وژس پرسکوئر72 و سیمون سیترات73.
جداسازی باکتری هدف بر اساس جدول افتراقی سالمونلا تیفی و انتخاب اهم تستها با ترتیب اتخاذ شده جهت راندمان بالای جداسازی، مطابق با جدول 1-3 انجام گرفت.

جدول 1-3 . مشخصات بیوشیمیائی گونه های انتروباکتریاسه

تستهای بیوشیمیایی استفاده شده برای افتراق باکتری هدف در ذیل آمده است.

1-4-3- تست سیمون سیترات
برای آزمایش سیترات از محیط کشت جامد سیمون سیترات (تهیه شده از شرکت مرک) استفاده شد. محیط سیترات حاوی سیترات سدیم ( منبع کربن) و یونهای آمونیوم( منبع نیتروژن) میباشد. در این آزمون، ابتدا توسط لوپ از کلنی باکتری برداشته و در سطح شیبدار محیط سیمون سیترات کشت داده شد و به مدت 24 ساعت در حرارت 35 درجه سانتیگراد در گرمخانه نگهداری شد. با رشد این باکتری، و واکنش هوازی معرف موجود در این محیط (آبی بروموتیمول) از رنگ سبز به آبی تغییر مینماید که نشانه وجود آنزیم سیتراتاز در باکتری است که توانسته سیترات را به اسیداستیک و اسیداگزالیک تبدیل کند که در چرخه کربس مورد استفاده قرار خواهد گرفت.
2-4-3- تست تریپل شوگر ایرون آگار(TSI)
محیطی شیبدار با عمق 2 تا 5 سانتیمتر و قرمز رنگ میباشد. معرف موجود در این محیط فنل رد است. برای بررسی نحوه مصرف قندهای گلوکز، لاکتوز، سوکرز و همچنین تولید گاز و تولید H2S توسط باکتری استفاده میشود. زمانیکه pH محیط خنثی است رنگ محیط قرمز است و زمانیکه عمل تخمیر صورت میگیرد محیط اسیدی شده و محیط زرد رنگ میگردد. از این محیط برای بررسی تخمیر قند گلوکز و لاکتوز استفاده میکنند. روش کشت در این تست شبیه سیمون سیترات است. یعنی هم کشت عمقی و هم کشت سطحی همزمان صورت میگیرد.
پس از کشت باکتری در این محیط ممکن است 3 حالت پیش بیاید:
1. زرد- زرد: باکتری هم قادر به تخمیر گلوکز و هم لاکتوز میباشد مانند ویبریوکلرا.
2. قرمز-زرد: باکتری قادر به تخمیر گلوکز و عدم تخمیر لاکتوز است مانند سالمونلا و شیگلا.
3. قرمز-قرمز: عدم تخمیر لاکتوز وگلوکز مانند بورخولدریا.
لازم است که محیط کشت بین 18 تا 24 ساعت در انکوباسیون قرار گیرد اگر نتایج آزمون زودتر از 12 ساعت مورد بررسی قرار گیرد نتیجه یا مثبت کاذب است یا تخمیر هنوز به اندازه کافی انجام نگرفته است.
حجم میکروبی که بر میداریم نباید زیاد باشد زیرا این باکتری ها پس از مصرف گلوکز شروع به استفاده از پپتون میکنند و رنگ محیط مجددا قرمز میشود.

3-4-3- تست SIM
تست SIM یکی دیگر از تستهای تشخیصی از خانواده انتروباکتریاسههاست. در این تست سه فاکتور تولید SH2، اندول و حرکت باکتری بررسی میگردد. تولید SH2 به صورت رسوب سیاه رنگ مشاهده میشود. اندول مثبت با ریختن معرف کواکس بر روی کشت 24 ساعته در این محیط با ایجاد رنگ ارغوانی در معرف ریخته شده نتیجه گیری میشود. اگر باکتری از نظر تولید اندول منفی بود ، بعد از ریختن معرف تغییر رنگی حاصل نمیشود. آخرین فاکتور یعنی حرکت مثبت نیز با ایجاد کدورت یکنواخت در محیط کشت مشخص میشود و اگر باکتری حرکت منفی باشد ، رشد باکتری فقط در خط مستقیم کشت مشاهده میشود و بقیه محیط شفاف باقی میماند.
4-4-3- تست اوره
این تست برای باکتریهایی که دارای آنزیم اورهاز هستند میباشد. برای این منظور ابتدا باکتری را در محیط اورهاز کشت میدهیم. محیط اوره از میتواند به صورت براث یا به صورت جامد باشد. اگر محیط به صورت براث بود باید مقداری از کلنی باکتریها را برداشته و در محیط مایع حل کنیم. اما اگر محیط اورهاز باکتری حاوی آگار بود باید آنرا به صورت سطح شیبدار در لوله ی آزمایش ریخته و سپس باکت
ریها را در آن کشت داد. معرف موجود در این محیط ترکیبی بهنام فنل رد میباشد بههمین خاطر رنگ محیط زرد کم رنگ یا صورتی روشن است. اگر باکتری انزیم اورهآز داشته باشد میتواند اورهی موجود در محیط را شکسته و در محیط کشت آمونیاک تولید نماید. آمونیاک به علت قلیایی کردن محیط باعث تغییر رنگ معرف به ارغوانی یا صورتی ارغوانی درآید. بعضی باکتریها مانند پروتئوسها قادرند این واکنش را با سرعت زیادی انجام دهند. اما برخی باکتریها مانند کلبسیلا و سیترو باکتر پس از 24 ساعت میتوانند رنگ محیط را تغییر دهند. جهت استریلیزاسیون این محیط حتما باید از فیلتر استفاده شود. زیرا اگر اتوکلاو صورت گیرد محیط خودبهخود قلیایی شده و قبل از کشت باکتری رنگ محیط به طور خودبهخودی تغییر میکند.

مطلب مرتبط :   پایان نامه ارشد با موضوعبیمار، جراحی، ایمنی، بیمارستان

5-3- روش تهی? گلسیرول استوک از باکتری مورد نظر
از روی پلیت LB آگار حاوی باکتری مورد نظر، یک کلنی تک تازه (16 تا 24 ساعته) برداشته و به 5 میلیلیتر محلولLB براث استریل تلقیح کرده و به مدت 3 الی 4 ساعت، با سرعت rpm 200در دمای 37 درجه روی شیکر انکوباتور گذاشته تا در طول موج 595 نانومتر به OD حدود 5/0 برسد. سپس 5 میلیلیتر گلیسرول 30 درصد (در LB براث) استریل را زیر هود به این لوله اضافه نموده، کاملاً هموژن کرده، در میکروتیوبهای 5/0 میلیلیتر تقسیم کرده و سریعاً به فریزر منفی 20درجه انتقال میدهیم.

6-3- روش استخراج DNA
استخراج DNA باکتری با روش دستی (استخراج با فنل- کلروفرم) طبق روشK?chl , 2005)) با کمی تغییرات انجام گرفت.
1-6-3- طرز تهی? محلولهای مورد نیاز برای استخراج DNA

جدول 2-3- محلول شماره I
EDTA
Tris base
Glucose
g 37/0
g 3/0
g 1
انحلال در آب مقطر، رساندن به حجم ml100 با آب مقطر. تنظیم 8pH =

جدول 3-3- محلول شماره II
SDS
NaOH
g 25/0
g 2/0

انحلال در ml20 آب مقطر با حرارت و رساندن به حجم نهایی ml 25 با آب مقطر. تنظیم6/12pH =
محلول شماره 1 در یخچال و محلول شماره 2 در دمای اتاق نگهداری میشوند. محلول شماره 2 حداکثر به مدت دو هفته پایداری داشته و پس از آن باید مجدداً بصورت تازه تهیه شود.

2-6-3- مراحل استخراج DNA
– یک کلنی ازکشت تاز? باکتری به 5 میلیلیتر محیط LB براث تلقیح شد و در انکوباتور شیکردار در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت یک شب گذاشته شد.
– 3 میلیلیتر از محیط حاوی باکتری رشد یافته، به مدت 3 دقیقه در rpm 13000میکروفیوژ شد.
– مایع رویی دور ریخته و رسوب تهیه شد.
– مقدار 200 میکرولیتر از محلول 1( pH 9/7 ، mM 2 Sodium EDTA ،mM 40 Tris_Acetate )
(Kado & Liu 1981) به رسوب حاصل اضافه و به خوبی مخلوط شد.
– به مقدار 2 برابرحجم محلول 1 ( 400 میکرولیتر) بافر لیزکننده یا محلول 2
(pH 6/12 ، SDS 1% ، NaoH 8/0%)، (Kado & Liu 1981) اضافه شده و در بنماری در دمای 65 درجه سانتیگراد جهت فعالیت بافر لیزکننده به مدت 10 الی 20 دقیقه گذاشته شد.
– مقدار 600 میکرولیتر فنل متعادل شده با تریس و 600 میکرولیتر کلروفرم به محلول اضافه کرده و بعد از 50 بار سر وته کردن کامل به مدت 5 دقیقه در rpm 13000فیوژ شد.
– فاز بالایی حاصل از میکروفیوژ یا فاز آبی با دقت کشیده شده و به تیوب جدید انتقال یافت.
– به 2 برابر حجم حاصل از فاز آبی ، برای حذف باقیمانده فنل ، کلروفرم اضافه کرده و دوباره به مدت 5 دقیقه در rpm 13000فیوژ شد.
– بار دیگر فاز بالایی یا فاز آبی کشیده شد و به تیوب جدید منتقل شد.
– به مقدار 6/0 حجم فاز آبی موجود ، اتانول 99% اضافه کرده و بعد از چند بار سر و ته کردن به فریزر 20- درجه سانتیگراد منتقل شد
– بعد از نیم ساعت از فریزر در آورده و به مدت 10 دقیقه در rpm 13000 فیوژ شد.
– مایع رویی را دور ریخته و به رسوب حاصل 50 میکرولیتر بافر شستشو (اتانل 70 درجه) اضافه کرده و به مدت 3 دقیقه در rpm13000 فیوژ شد
– بافر شستشو را دور ریخته و رسوب در دمای اتاق چند دقیقه خشک شد.
– رسوب در 20 میکرولیتر آب مقطر حل شد
– مقدار 5/0 میکرولیتر آنزیم RNase به آن اضافه شد و در انکوباتور 37 درج? سانتیگراد به مدت 15 دقیقه گذاشته شد
– در نهایت، 5 میکرولیتر از DNA استخراج شده ، روی ژل آگارز 1% به مدت 40 دقیقه در 80 ولت الکتروفورز شد.

مطلب مرتبط :   پایان نامه ارشد با موضوعپرستاران شاغل، بهبود مستمر

7-3- تعیین غلظت DNA با دستگاه اسپکتروفتومتر
برای تعیین غلظت محصول استخراج DNA، معمول است که از جذب در دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 260 نانومتر استفاده میشود. دستگاه مورد استفاده ما، دستگاه Biowave, UK)) بود که به صورت ذیل برای آن عمل میشود:
ابتدا وارد تنظیمات DNA دستگاه شده و ضریب رقت 50/1 را برای آن در نظر گرفته و ثبت میکنیم. سپس در کووت دستگاه، 50 میکرولیتر آب مقطر ریخته و جذب آن را صفر میکنیم. سپس کووت را خالی کرده و 50 میکرولیتر از محلول با رقت 50/1 محلول حاوی DNA را در آن میریزیم. سپس جذب نمونه را بر علیه آب مقطر میسنجیم. دستگاه مقادیر زیر را به ما ارائه میدهد:
– غلظت نمونه بر حسب (ng/?l)
– جذب در 260 نانومتر
– جذب در 280 نانومتر
– جذب در 320 نانومتر
– نسبت جذب 280/260
– نسبت جذب 320/260
نسبت جذب 280/260 نشاندهندهی میزان آلودگی با پروتئینهاست که بهترین محدودهی آن در نزدیکی 8/1 است. نسبت جذب 320/260 نشاندهندهی میزان آلودگی نمونه با پلیساکاریدهاست که محدوده ان باید بین 2 تا 5 باشد.
8-3- الکتروفورز
یکی از روشهای بررسی کیفیت DNA (استخراج شده از بافت ها و یا محصولات PCR) استفاده از الکتروفورز ژل آگارز است. بهاین ترتیب میتوان از سلامت DNA استخراجی و یا تخریب آن آگاه شد.
DNA به خاطر بارهای منفی گروههای فسفاتیاش، زمانی که در ژل آگارز ریخته میشود تحت نیروی الکتریکی د
ستگاه قرار گرفته و با عبور از بین حفرات موجود در ژل از قطب منفی به سمت مثبت حرکت میکند. هر چه طول قطعات کوتاهتر باشد، عبور از حفرات سریعتر صورت میگیرد و مسافت بیشتری را در ژل طی میکند. در مقابل قطعات بلندتر به سختی از حفرات عبور کرده و مسافت کمتری را طی میکنند. الکتروفورز بر اساس روشهای پیشنهادی Kolmodin (1997) انجام شد.
در صورت سالم بودن نمونههای ژنومی، تک باندهای واضح و روشنی به موازات هر چاهک باید تشکیل شود. اما در صورت تخریب ژنوم حین استخراج، DNA به صورت اسمیر یا هالهای روشن به موازات چاهک مربوطه ظاهر میشود که نشان دهنده نامطلوب بودن استخراج است.
از مهمترین دلایل تشکیل چنین اسمیرهایی، عدم دقت لازم حین استخراج و یا فشار مکانیکی روی نمونههای DNA (ضربه های وارده با سمپلر به رسوب DNA و یا ورتکس شدید) میتواند باشد.
برای حرکت DNA در ژل، از ولتاژ 90-80 ولت استفاده می شود که به ازای هر یک سانتیمتر از ژل، به آن ولتاژ 5 تا 10 ولت داده میشود. غلظت ژل نیز بر اساس طول قطعات DNA در نظر گرفته میشود. برای قطعات ژنومی معمولاً از غلظت 7/0 تا 1 درصد و برای محصولات PCR از 1 تا 2 درصد استفاده میشود. برای مشاهده نمونههای DNA بارگذاری شده در ژل از رنگ فلوئورسانس ایتیدیوم بروماید استفاده میشود که با قرار دادن ژل در دستگاه نمایشگر ژل به کمک نور UV میتوان باند DNA را مشاهده کرد.

1-8-3- طرز تهیه ژل آگارز
برای الکتروفورز نمونههای DNA، عموماً از ژل آگارز و بافر TBE استفاده میشود. بافر TBE، برای ساختن ژل و سیال هادی جریان الکتروفورز استفاده میگردد.

2-8-3- طرز تهی? بافر (1X)TBE

جدول 4-3- مواد بافر (1X)TBE
EDTA

Boric acid

Tris

g75 /0
g 97/2
g 9/10

مواد مذکور را در 800 میلیلیترآب مقطر حل کرده و سپس با آب مقطر به حجم 1000 میلیلیترمیرسانیم.
لازم بهذکر است که میتوان از بافر TBE (0.5X) نیز برای الکتروفورز استفاده کرد. به شرط آنکه ژل آگارز را نیز با همان غلظت از بافر TBE تهیه نمود که در این پایان نامه نیز تمامی ژلهای آگارز با TBE (0.5X) ساخته شد.
قبل از تهیه ژل آگارز، سینی مخصوص ژل را آماده کرده و شانه مخصوص در سینی قرار داده میشود. فاصله شانه تا کف سینی معمولاً باید 2 تا 3 میلیمتر باشد. سپس بسته به ظرفیت سینی ژل برای ایجاد چاهک مناسب ( مثلاً در اینجا 40میلیلیتر) ، مقدار 4/0 گرم پودر آگارز را در 40 میلیلیتر بافر TBE حل کرده تا ژل 1% فراهم شود. سپس روی شعله متوسط حرارت داده تا پودر آگارز حل شده و محلول کاملاً شفاف شود.
سپس کمی صبر کرده تا محلول کمی سرد شده(حدود 55 درجه) و سپس 1 میکرولیتر از رنگ اتیدیوم بروماید (mg/ml10) به آن افزوده، 10 بار بصورت عدد 8 لاتین هم زده و در سینی ژل دارای شانه ریخته شد تا سرد شود. پس از اطمینان از بسته شدن کامل ژل، به آرامی شانه را از داخل آن درآورده و سینی حاوی ژل را داخل تانک

Comments (0):

Write a comment: